Vorlesung:
Grundlegende Fertigkeiten für die wissenschaftliche Arbeit

von Arnd Baumann und Stephan Frings III. Planung und Durchführung von Experimenten    (INHALT)

Beispiel: Expression eines Proteins in einer Zellkultur Zur Untersuchung der Eigenschaften eines Proteins wird zunächst das dazugehörige Gen isoliert, und dann in Wirtszellen exprimiert.   Die Abbildung rechts zeigt solche Wirtszellen, die Zellkultur HEK 293, die ein Fremdgen exprimieren. Das dabei entstehende Protein wurde mit einem rot-markierten Antikörper sichtbar gemacht.   Mit Hilfe einer Westernblot-Analyse soll untersucht werden, wie groß dieses Protein ist. Dazu werden die Zellen aufgeschlossen, und ein Proteinextrakt wird auf einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die einzelnen Proteine werden mit dieser Methode nach Größe sortiert.

Nach Übertragung der größensortierten Proteine auf eine Folie ("Blotting"), können die einzelnen Proteine mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Die Antikörper tragen einen Label, der durch Chemilumineszenz einen Photofilm schwärzt. Schwarze Banden auf dem Film zeigen also die Position des jeweiligen Proteins nach der Elektrophorese. Durch Vergleich mit Größenstandards (Proteine bekannter Größe) kann aus der Position der Bande die Größe des Testproteins in kiloDalton (kDa) ermittelt werden.   Der ganz rechts abgebildeten Westernblot von transfizierten Zellen ("Test") wurde mit Antikörpern gegen das Testprotein erhalten. Er zeigt zwei Banden. Die Aussagekraft dieses Tests allein ist aber gering, denn es ist nicht sicher, ob die beiden Banden vom Testprotein stammen oder von einem zelleigenen Protein. Um das zu klären braucht man eine Negativkontrolle: Man testet einen Proteinextrakt von nicht-transfizierten Zellen mit demselben Antikörper. Bei diesem Kontrollversuch ist nur noch eine Bande zu sehen - ein zelleigenes Protein ("Negativkontrolle") . Die in der Negativkontrolle veschwundene Bande um 90 kDa ist also das Testprotein. Positivkontrollen dienen zur Überprüfung der Methode. Hierzu werden die Zellen nicht mit dem Testprotein, sondern mit dem Gen eines gut charakterisierten Proteins von bekannter Größe transfiziert. Wenn der Westernblot mit einem Antikörper gegen dieses Protein eine Bande an der erwarteteten Position bringt ("Positivkontrolle"), ist nachgewiesen, daß die Methode funktioniert.

Reproduzierbarkeit   Kein Resultat kann als gesichert gelten, solange nicht erwiesen ist, daß wiederholte Experimente unter den gleichen Bedingungen die gleichen Ergebnisse bringen. Insofern ist die Reproduzierbarkeit eine unverzichtbare Kontrolle.   Zum vollständigen Resultat eines Experiments gehören deshalb Angaben über den Mittelwert, die Streuung der Daten um den Mittelwert sowie die Anzahl der durchgeführten Versuche.